Avaliação taxonômica e prospecção de enzimas com potencial biotecnológico por fungos isolados de líquens antárticos

A Antártica é um habitat de intensas caracteríticas climáticas que abriga uma riqueza microbiana ainda desconhecida, particularmente fungos associados a liquens desse ambiente. Nesse sentido, objetivou-se recuperar e identificar à diversidade de fungos presentes em amostras de liquens Antárticos e verificar a aptidão na produção de enzimas extracelulares ativas a temperaturas baixas. Os liquens utilizados foram coletados em ilhas do arquipélago das Shetlands do Sul (Antártica marítima) durante expedições brasileiras realizadas nos verões de 2015/2016 e 2016/2017 com um número total de 28 amostras. No processamento, as amostras foram homogeneizadas em solução salina (0,85%), diluídas e plaqueadas para a semeadura em dois meios de cultura sólidos: Yeast Malt Ágar (YMA) e Caldo Sabourand Dextrose (SDB) diluído 10 vezes. Posteriormente, os fungos isolados foram preservados em glicerol 20% por ultracongelamento -80 °C. Na etapa seguinte, os isolados foram submetidos aos ensaios de produção de enzimas extracelulares, em meios de cultura acrescidos de substratos específicos: lipase (azeite de oliva), amilase (amido), celulase (carboximetilcelulose), protease (leite desnatado), pectinase (pectina) e esterase (tween 80). A identificação taxonômica foi iniciada a partir da visualização macro e microscópica, seguida da realização de PCRs diretas das colônias em crescimento para a amplificação das regiões D1/D2 da região 26S do DNAr de leveduras. Após essa etapa, o DNA obtido foi submetido ao sequenciamento e as sequências obtidas foram analisadas filogeneticamente. Foram isolados 399 fungos (368 leveduras e 31 filamentosos), o maior número foi para os liquens Lecania brialmonttii, Caloplaca regalis, Rhicarpon geographicum, Usnea aff. capillacea e Cladonia metacorallifera, sendo um dos primeiros relatos da presença fúngica associada a esses liquens antárticos. Entre os isolados identificados, a maioria foi do filo Basidiomycota com Vishniacozyma victoriae, Mrakia niccombsii, Mrakia blollopis, Bannozyma yamatoana e Tremella sp. E a cepa 3.L35 como uma potencial espécie nova para o gênero Vishniacozyma. Dentre os isolados Ascomycota, observou-se Candida davisiana e Pseudogymmoascus sp., este último um fungo filamentoso. Cerca de 112 isolados demonstraram atividade positiva para proteases (53%), celulases (53%), esterases (50%), lipases (26%), amilases (21%) e pectinases (17%), com IEs variando de 1,05 a 5,33, com os maiores halos de isolados produtores de celulase. Houve atividade de celulases dos 15 aos 35 °C com o isolado 7.L4. O presente estudo confirma que os liquens Antárticos são fontes de fungos, especialmente leveduras, e demonstra o potencial desse grupo em produzir de enzimas extracelulares ativas em baixas temperaturas, com possibilidades de aplicações biotecnológicas promissoras em diferentes faixas térmicas, como a enzima celulase.

Antarctica is a habitat of intense climatic characteristics that harbors a microbial richness still unknown, particularly fungi associated with lichens from that environment. In this sense, the objective was to recover and identify the diversity of fungi present in samples of Antarctic lichens and to verify the aptitude in producing active extracellular enzymes at low temperatures. The lichens used were collected from islands in the South Shetlands archipelago (Antarctic maritime) during Brazilian expeditions carried out in the summers of 2015/2016 and 2016/2017 with a total number of 28 samples. In processing, the samples were homogenized in saline solution (0,85%), diluted and plated for sowing in two solid culture medium: Yeast Malt Agar (YMA) and Sabourand Dextrose Broth (SDB) diluted 10 times. Subsequently, the isolated fungi were preserved in 20% glycerol by freezing at -80 ° C. In the next stage, the isolates were subjected to extracellular enzyme production assays, in culture medium with specific substrates: lipase (olive oil), amylase (starch), cellulase (carboxymethylcellulose), protease (skimmed milk), pectinase (pectin) and esterase (tween 80). Taxonomic identification was initiated from macro and microscopic visualization, followed by direct PCRs from growing colonies to amplify the D1/D2 regions of the 26S region of yeast DNAr. After this stage, the obtained DNA was submitted to sequencing and the obtained sequences were phylogenetically analyzed. 399 fungi (368 yeasts and 31 filamentous) were isolated, the largest number was for Lecania brialmontii, Caloplaca regalis, Rhicarpon geographicum, Usnea aff. capillacea and Cladonia metacorallifera, being one of the first reports of the fungal presence associated with these Antarctic lichens. Among the identified isolates, the majority were from the phylum Basidiomycota with Vishniacozyma victoriae, Mrakia niccombsii, Mrakia blollopis, Bannozyma yamatoana and Tremella sp. And the strain 3.L35 as a potential new specie for the genus Vishniacozyma. Among the Ascomycota isolates, it was observed Candida davisiana and Pseudogymmoascus sp., the last one a filamentous fungus. About 112 isolates demonstrated positive activity for proteases (53%), cellulases (53%), esterases (50%), lipases (26%), amylases (21%) and pectinases (17%), with IEs ranging from 1,05 to 5,33, with the largest halos isolated cellulase producers. Cellulase activity occurred from 15 to 35 °C with isolate 7.L4. The present study confirms that Antarctic lichens are sources of fungi, especially yeasts, and demonstrates the potential of this group to produce extracellular enzymes active at low temperatures, with possibilities for promising biotechnological applications in different thermal bands, such as the cellulase enzyme.

Acesso restrito definido pela autora. Provável liberação em 21 fev. 2021.
Acesso aberto em 09 maio 2023.