Partição e caracterização bioquímica de frutosiltransferase produzida por _Aspergillus sp_. UCP 1269 por sistema de duas fases aquosas–peg/citrato.

A Frutosiltransferase é uma importante enzima utilizada em estudos bioquímicos, tendo sua aplicação na indústria com a finalidade de obtenção de frutooligossacarídeos (FOS). A produção destes frutooligossacarídeos ocorre através da síntese enzimática da frutosiltransferase pela reação de transfrutolisação na sacarose. Os FOS são oligossacarídeos denominados de açúcares indigeríveis e não convencionais, sendo classificados como prebióticos, proporcionando assim o crescimento seletivo da microbiota benéfica aos organismos humano ou animal. O objetivo deste estudo foi avaliar a partição da frutosiltransferase produzida a partir do micro-organismo Aspergillus sp. UCP 1269 isolado do solo da caatinga, utilizando o Sistema de Duas Fases Aquosas (SDFA)composto de polietilenoglicol (PEG)/Citrato. O SDFA foi realizado utilizando um planejamento fatorial 23 com 4 pontos centrais, tendo como variáveis independentes a massa molar do PEG (MMPEG), concentração do PEG (CPEG) e concentração do citrato (CCIT). Foram realizados estudos de caracterização bioquímica quanto ao pH e temperatura e parâmetros cinéticos. Os resultados indicaram purificação parcial da frutosiltransferase no ensaio 5 no planejamento experimental do SDFA, sendo composto de 400g/mol MMPEG; 20% (m/m) CPEG e 20% (m/m) CCIT em pH 7. Foi observado neste ensaio alto valor de recuperação em atividade na fase inferior de 123,66%, tendo um fator de purificação de 2,26, e o coeficiente de partição de 0,019, demonstrando a partição da enzima preferencialmente para a fase inferior do sistema. Com relação a caracterização enzimática foi observado a estabilidade de temperatura sobre a FTas ocorreu na faixa 30ºC à 40ºC, já a a temperatura ótima ocorreu entre 50ºC e 60ºC, com relação a estabilidade de pH, foi observado que a FTas foi relativamente estável em pH 9 no tempo de 4hrs e o pH ótimo valor de pH ótimo ocorreu entre (4,0 a 7,0), com pico de atividade em pH 5. Quanto ao efeito de íons sobre a FTas, foi observado que os íons: Zn2+, k+ , Ca+ e Fe3+ não potencializou a reação enzimática, todavia o Cu2+ teve um efeito negativo, reduzindo a atividade enzimática em 40% de sua atividade. A cinética enzimática da frutosiltransferase apresentou Km 31 mg/mL e Vmax 5,4 μmol/ml btidos para atividade hidrolítica. O Sistema de Duas Fases Aquosas foi eficiente no processo de pré-purificação da frutosiltranferase, demonstrando que o SDFA PEG/Citrato é um ambiente químico favorável e que proporciona a estabilidade da atividade enzimática, sendo um processo passível de aplicação industrial para obtenção de frutooligosacarídeos. 

Fructosyltransferase is an important enzyme used in biochemical studies, and its application in industry for the purpose of obtaining fructooligosaccharides (FOS). The production of these fructooligosaccharides occurs through the enzymatic synthesis of fructosyltransferase by the sucrose transfructolysis reaction. FOS are oligosaccharides called indigestible and unconventional sugars and are classified as prebiotics, thus providing selective growth of beneficial microbiota to human or animal organisms. The aim of this study was to evaluate the fructosyltransferase partition produced from Aspergillus sp. CPU 1269 isolated from caatinga soil using the aqueous two-phase system (SDFA) composed of polyethylene glycol (PEG) / citrate. The SDFA was performed using a 4-point factorial design 23, having as independent variables PEG molar mass (MMPEG), PEG concentration (CPEG) and citrate concentration (CCIT). Biochemical characterization studies were performed regarding pH and temperature and kinetic parameters. The results indicated partial purification of fructosyltransferase in assay 5 in the SDFA experimental design, consisting of 400g / mol MMPEG; 20% (w / w) CPEG and 20% (w / w) CCIT at pH 7. It was observed in this test a high recovery value in activity in the lower phase of 123.66%, having a purification factor of 2.26, and the partition coefficient of 0.019, demonstrating the enzyme partition preferentially for the lower phase of the system. Regarding the enzymatic characterization it was observed the temperature stability over the FTas occurred in the range 30ºC to 40ºC, whereas the optimum temperature occurred between 50ºC and 60ºC, regarding the pH stability, it was observed that the FTas was relatively stable at pH 9. 4hrs time and optimum pH optimal pH value occurred between (4.0 to 7.0), with peak activity at pH 5. As for the effect of ions on FTas, it was observed that the ions: Zn2 +, k +, Ca + and Fe3 + did not potentiate the enzymatic reaction, however Cu2 + had a negative effect, reducing the enzymatic activity by 40% of its activity. The enzymatic kinetics of fructosyltransferase showed Km 31 mg / mL and Vmax 5.4 μmol / mL obtained for hydrolytic activity. The Aqueous Two-Phase System was efficient in the fructosyltransferase pre-purification process, demonstrating that SDFA PEG / Citrate is a favorable chemical environment and provides the stability of enzymatic activity, being a process that can be applied industrially to obtain fructooligosaccharides.